植物免疫与植物免疫诱导蛋白的开发与应用——以Harpin蛋白为例（下）

植物免疫诱抗蛋白研究进展

1. 我国自主研发免疫诱导蛋白

河北中保绿农作物科技有限公司生产的阿泰灵（极细链格孢激活蛋白和氨基寡糖素混合物），在中国获得农药登记并于2014年上市，产品中的极细链格孢激活蛋白是由中国农业科学院植物保护研究所的的邱德文研究员研发的。阿泰灵的登记作物和防治对象包括柑橘树溃疡病、烟草病毒病、水稻病毒病、番茄病毒病、马铃薯病毒病、白菜软腐病和西瓜枯萎病。极细链格孢蛋白是从天然菌株真菌中提取出的高活性免疫诱抗蛋白，通过外源施用，可有效诱导激活植物自身免疫系统（PTI/ETI），增强抗病相关基因上调，促使植物细胞分泌水杨酸、茉莉酸、乙烯、几丁质酶、蛋白溶解酶及植物内源激素，调控细胞内部磷酸化与活性氧过程，进而达到抗病、抗逆、增产的效果。

由中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室与北京中捷四方生物科技股份有限公司共同研发的一种新型植物免疫激活蛋白即大丽轮枝孢激活蛋白产品维大力（VDAL），可以通过调控植物体内多种激素信号通路，激活PTI及ETI免疫反应，诱导植物产生抵抗生物（病害、虫害）和非生物（高温、干旱、寒冷等）胁迫的能力，促进植物生长发育。该产品在黄瓜、番茄、辣椒、生姜及多种十字花科蔬菜，水稻、小麦、玉米、棉花等大田作物，苹果、大枣、樱桃、西瓜等瓜果在内的五十余种作物上开展了大量效果试验。试验证明，植物免疫激活蛋白维大力（VDAL）在抗病、抗逆、促生长、增产提质等方面效果显著。

湖北微生元生物科技有限公司生产的源自革兰氏阴性病原菌丁香假单胞菌的Pss Harpin蛋白，自称植物免疫激蛋白商品名“微生元”，已在农业部以氨基酸肥料名义获得肥料登记。目前正在筹备申请农业部农药产品登记。

2. 我国引进销售harpin蛋白

如前所述，美国伊甸生物技术公司的MessengerR是最早在中国获得登记Harpin蛋白类产品，由湖南农大科技开发有限公司在国内经销，主要用于番茄、辣椒、烟草和水稻，功效包括抗病、调节植物生长和增产。需要指出的是伊甸公司早被美国PHC收购，其产品也尽归PHC。

3. PHC公司的Harpin蛋白产品介绍

PHC是一家专门提供生物产品（尤其是基于Harpin的产品）的领先公司，公司的核心专利产品作为“植物疫苗”，让植物更健康，更能抵抗疾病和逆境，从而提高作物产量和品质。PHC官网信息声称，PHC的业务是由Harpin αβ（第二代Harpin蛋白）的销售推动的，Harpin αβ是一种重组蛋白，作为一种强大的生物刺激剂，可以提高作物的产量和质量。

（1）第一代Harpin蛋白产品MessengerR

革兰氏阴性植物致病菌与动物致病菌一样，在与寄主植物相互作用时，利用一种复杂的系统分泌蛋白质，从而引起植物病害。革兰氏阴性菌的这种分泌系统被称为III型分泌系统（T3SS），它的结构蛋白由超敏反应和致病性（hrp）基因编码。

Harpin蛋白就是由革兰氏阴性植物病原细菌通过III型分泌系统分泌的一类富含甘氨酸且热稳定的蛋白质。许多研究表明，这些蛋白质的主要作用部位是植物组织细胞外空间，不像细菌效应蛋白在植物细胞内起作用。第一个植物病原菌来源的harpin蛋白（HrpN）是由康奈尔大学魏中民团队于1992年从梨火疫病菌中作为无细胞的超敏反应（HR）引发剂被发现的，已确定HrpN有各种不同的功能。

Harpins是一类独特的蛋白质，具有共同的特征，与其他细菌蛋白质不同。首先，从harpin的氨基酸组成来看，它们携带了相对较多的甘氨酸和丝氨酸残基，而没有或很少携带半胱氨酸和芳香氨基酸。大多数harpin蛋白含有的甘氨酸超过15%，这些甘氨酸通常聚集在这些蛋白质的特定区域。

康奈尔大学的Harpin蛋白被美国伊甸生物科学公司开发成制剂产品并于2000年获得美国环保局的登记。该蛋白产品（商品名为MessengerR）还获得了美国2001年总统绿色化学挑战奖（小企业奖）。该技术被誉为植物保护和食品安全的绿色化学革命。

美国EPA将此产品归为生物化学农药。它是由经遗传修饰的大肠杆菌K12发酵生产的，产品中的大肠杆菌细胞已在发酵后杀死。该产品适用于大田和温室中的所有食品生产，还有草皮、树木及观赏植物，可广泛地用于真菌、细菌和病毒病的防治，包括细菌性叶斑病、细菌性斑点病、细菌性枯萎病、枯萎病、疫霉根腐病、茎腐病、鞘枯病、苹果痂病、火疫病、灰霉病、黑腐病、黑斑病、黄瓜花叶病毒、根结线虫、烟草囊线虫和烟草花叶病毒（TMV）。此外，对植物生长有显著促进作用，对某些昆虫有抑制作用。生长增强可能包括提高发芽率、增加整体植物活力、加速开花和坐果、提前成熟以及提高产量和最终收获的质量。

在温室环境中使用MessengerR的结果包括：增加植物光合作用、增加植物养分吸收、增加植物生物量、改善根系发育、增加种子萌发、花期提前和改善果实发育。

2001年，MessengerR经我国农业部农药检定所审定通过取得了农药临时登记证，证号为：LS200160。2007年获中国农药正式登记（PD20070120）和分装登记证（PD20070120F070064），首批推荐在番茄、辣椒、烟草和油菜上使用。目前该产品的正式登记已更新，有效期至2027年5月7日。登记的用途和使用剂量（见表3）。该产品在国内市场的原商品名为“康壮素”，该产品由湖南农大科技开发有限公司在国内代理销售。

（2）PHC公司的第二和第三代Harpin蛋白产品

PHC的第二代harpin蛋白产品是基于Harpinαβ的产品ProactR等。

使用ProactR的益处包括激活植物生长过程、刺激钙的吸收、改善果实中的钙结合、激活植物对非生物的耐受性、增加非生物胁迫的抗逆性、增加光合作用、提高作物品质、显著延长货架寿命以及提高养分密度。

继第二代Harpin蛋白之后，PHC又登记了第三代Harpin肽类产品PHC91398（2020年）和PHC25279（2022年）。

PHC91398的有效成分Ea Peptide 91398是一种合成肽，由梨火疫菌的harpin蛋白HrpW衍生而来。该肽具有一种无毒的作用模式，当应用于植物生长期时，可作为植物反应激发子。Ea Peptide 91398通过水杨酸和乙烯/茉莉酸依赖的信号传导诱导天然植物防御，在处理过的植物中激活超敏反应。这种反应导致植物组织中快速、局部的细胞死亡，进而引发一系列代谢反应，导致系统的基因表达和植物自然生长和防御系统的激活。植物内部的这些变化有助于抵抗细菌和真菌感染，以及抑制线虫产卵。Ea Peptide 91398的登记用途包括通过种子处理或叶面施用来处理各种作物，在农业上的应用主要包括：一是栽种前进行幼苗叶面或根部浸渍；二是温室或大田叶面施用，可以使用传统的地面或空中喷滴设备；三是作为种子处理剂。

衍生自Harpin蛋白的肽（PDHP 25279）是一种微生物产生的肽，以1%的浓度配制成最终用途产品名为PHC 25279的可湿性喷雾干燥粒剂。

PDHP 25279是一种由28个氨基酸组成的肽，从植物致病菌梨火疫病菌中发现的harpinW蛋白中提取。PDHP 25279是不直接影响目标有害生物的第三代PDHP。相反，PDHP 25279的作用模式被认为是通过水杨酸（SA）和乙烯/茉莉酸依赖的信号传导诱导植物的自然防御机制，进而激活超敏反应（HR），最终在植物中引发系统性获得性抗性。HR的特点是在多肽渗透到植物叶片的细胞间隙后，植物组织中的细胞迅速、局部死亡。该反应在被处理植物中启动了一系列复杂的代谢反应，引起全身性的基因表达，引发植物的自然生长和防御系统，从而增强植物对真菌和细菌疾病的抵抗力。

PHC 25279适用于大田或温室，可在移栽前进行叶面或根系浸渍，或作为种子处理剂，或在蔬菜作物、观赏植物、烟草、小型水果作物、景观植物和草坪上进行叶喷。

该产品可用于洋蓟、芦笋、土豆、玉米、甜玉米、棉花、大豆、油菜籽、向日葵、甜菜、小麦、草坪、饲草、甘蔗、烟草、浆果、鳄梨、柑橘、杏仁、核桃、苹果、梨、核果、葡萄、啤酒花、猕猴桃、芦荟、香蕉、咖啡、无花果、药用植物、芒果、薄荷、木瓜、菠萝、树木、草皮和观赏植物。

至此，PHC在美国EAP登记的harpin蛋白活性成分有harpin、harpin αβ、Ea Peptide 91398和PHC 25279等。Harpin是一种由404个氨基酸组成的蛋白，于2000年首次获得登记；Harpinαβ则是一种由412个氨基酸组成的蛋白，由来源于多种植物病原菌的Harpin蛋白片段组成，于2004年获得登记；Ea Peptide 91398是一种合成的含27个氨基酸的肽，来自梨火疫病菌的hrpW蛋白，它是产品PHC 91398的有效成分，于2020年首次获得登记；PDHP 25279是一种由28个氨基酸组成的肽。

PHC在美国登记的所有基于harpin蛋白的产品（见表4）。

PHC在巴西登记的SaoriR也是基于Harpinαβ protein的大豆种子处理剂（1.0%WP），用于防治大豆锈病。

另据报道，PHC目前正在申请新产品PHC68949在美国和巴西的登记。这个产品将作为生物杀线虫剂用于防治植物针线虫、根结线虫、根腐线虫、南方根结线虫、短粗根线虫等。

4. Harpin蛋白的作用机制

Harpin蛋白在处理过的植物中启动了一系列复杂的代谢反应，导致自然基因表达并诱导植物的自然防御和生长系统。它是从引起苹果和梨的火疫病病菌中分离出来的。作为一种生物化学农药，其是一种广谱的杀菌剂替代品，对多种真菌、细菌和病毒疾病有效，该产品还有助于抑制某些昆虫、螨虫和线虫，并促进植物生长。Harpin是在大肠杆菌中通过将编码Harpin蛋白的DNA片段从火疫菌转移到大肠杆菌菌株K-12中通过发酵进行商业化生产。产生harpin的菌株被认为是大肠杆菌的一种衰弱菌株，它不能在人体消化道中生长，也不能在环境中生存。大肠杆菌K-12细胞在发酵过程结束时被杀死和裂解，然后提取Harpin蛋白和其他细胞成分，制成最终用途产品MessengerR。

Harpin对植物病原体没有直接的抑制或毒性作用，因此对有害生物不会造成抗性。

据PHC声明，Harpin αβ蛋白是第二代harpin产品。Harpin αβ蛋白是以Harpin为基础的活性成分，在化学结构和生物学上与Harpin蛋白（2000年4月注册的MessengerR）相似。它通过启动植物的复合防御机制而起作用，在某些方面与动物的广谱免疫反应类似。这种保护性反应使植物能够在生长期内和收获之后抵抗各种真菌、细菌和病毒的危害。与大多数农药化学物质的作用不同，Harpin αβ不直接与病虫害相互作用，因此，预计这些有害生物不会对Harpin αβ产生抗性。除了预防各种疾病外，Harpin αβ促进植物生长，提高许多作物的产量和质量，包括粮食作物、草皮和观赏植物等。正如第一个注册的Harpin蛋白一样，Harpin αβ的使用也不会对人类健康或环境造成不利影响的。

Harpin αβ蛋白是由其他植物病源细菌中发现的四个harpin蛋白片段组成的蛋白质分子。Harpin αβ蛋白的商业生产方法是将编码Harpin αβ的DNA序列放入通常在实验室和商业上使用的大肠杆菌（E. coli K-12）弱菌株中再发酵生产的。经基因修饰的大肠杆菌K-12在发酵过程中可以产生大量的Harpin αβ蛋白。

Harpin αβ蛋白激活植物的天然防御机制，使其产生系统获得性抗性（SAR），这是一种能够诱导植物持续抵御病原微生物侵害的防御机制。

一些harpin被证明具有毒力活性，可能是因为它们参与了效应蛋白在植物细胞质中的易位，基于这个功能，harpin也被认为是易位子。它们在人工膜中形成孔，具有与脂质组分结合及寡聚的能力。当harpin蛋白直接应用于植物或在植物细胞中表达时，这些蛋白会引发多种有益的反应，如诱导对各种病原体和昆虫的防御反应和促进植物生长。因此，harpin可以作为病原菌毒力因子（或易位子）、HR和免疫应答激发子以及植物生长促进剂等。

基于Harpin蛋白的产品监管和登记

Harpin蛋白作为一种新型的生物产品，因其作用方式独特，其登记监管成为灰色地带，截至目前，美国仍然作为生物化学农药予以登记。而PHC在其他国家如巴西予以生物杀菌剂登记用于大豆种子处理，也有作为肥料登记用于各类作物增产。

近年来，生物刺激剂类产品日益受到热捧。欧盟出台新的肥料法规，将其作为一类特别物质予以监管。美国2022年也颁布生物刺激剂新法规，将其作为非农药产品归美国农业部监管。因此，PHC的相关产品在美国登记为生物化学农药。中国目前尚没有生物刺激剂的官方定义和登记监管政策，但是美国的MessengerR和中国的极细链格孢激活蛋白均获得中国农药登记，微生元的产品获得肥料登记。

1. 第一代产品MessengerR登记时向EPA提交的资料

（1）理化性质评价

提交的理化性质报告（见表5）。

（2）人类健康风险评价

毒理学评价：a. 急性毒性试验数据，提交的急性毒性数据（见表6）；b. 亚慢性和慢性毒性；c. 对免疫和内分泌系统的影响（剂量反应评估，饮食暴露风险表征，职业、居住区、学校和日托的暴露和风险表征，饮水暴露和风险表征，敏感亚群的特别是婴儿和儿童的急性和慢性饮食风险，来自多个途径的包括口服、皮肤和吸入途径的总暴露以及累积效应等）。

（3）环境风险评估

a. 生态毒性研究

提交的对非靶生物的毒性数据（见表7）。

b. 条件注册数据要求

申请者提交了大水蚤21天生命周期毒性和致病性研究。

c. 环境现况及地下水资料

申请人提交了如下试验研究：Harpin的环境归宿和降解试验，MessengerR中内毒素污染监测，MessengerR中残留抗菌活性分析，Messenger潜在抗性基因分析，生产MessengerR的细胞系在植物表面和土壤中的存活。

d. 生态暴露和风险表征

叶面使用模式使MessengerR有可能接触到所有陆地上的非目标生物。然而，迄今为止的非靶影响研究数据（见表6）表明MessengerR对鸟类、淡水鱼和水生无脊椎动物、植物幼苗和淡水藻类实际上是无毒的。根据蜜蜂研究的结果，harpin蛋白对蜜蜂也实际无毒（与阳性对照乐果比较）。

2. 第三代Harpin蛋白产品登记提交的资料

申请第三代产品PHC-91398的登记时，PHC将harpin、harpinαβ和Ea Peptide 91398之间的大部分非靶点数据进行了桥接。此外，申请人提交了产品表征、生物信息学分析、蜜蜂研究（急性接触和口服）、急性毒性（口服、皮肤、吸入）、刺激试验（急性眼睛、皮肤）、皮肤致敏和用Ea Peptide 91398进行的蛋白酶降解研究数据结果。亚慢性、致突变性和发育毒性数据要求提交了豁免理由。

这些研究和豁免的理由表明，PDHP 91398的有效成分Ea Peptide 91398没有毒性、诱变性、发育毒性或过敏原性。在审查了提交的和可公开获得的数据和信息后，EPA确定Ea Peptide 91398的残留物不会造成危害，并且其使用不会对人类健康或环境造成不利影响。在批准该活性成分后，EPA将要求进行额外的研究作为注册期限；必须在注册后一年内提供1% Ea Peptide 91398在华氏110度（摄氏43.3度）下储存稳定性的确认研究。此外，EPA正在根据FIFRA第3（c）（5）条注册Ea peptide 91398作为种子处理、常规喷雾和种植前叶/根浸渍剂，用于所有食品中的农业和商业种子处理。此外，豁免Ea Peptide 91398的所有用途的最大残留限量要求。

同样，支持第三代活性成分PDHP 25279及其产品PHC 25279的登记所需要的产品特性、对人类健康和非目标生物影响的数据部分基于这些先前登记的harpin活性成分成分和毒理学相似性，尤其是Ea Peptide 91398及其相应的制剂产品PHC 91398的数据。

结语

使用更为安全和环保的措施已成为促进植物生长和病虫草害防治的有效手段，也是当今植物保护领域未来发展的方向，成为植物免疫诱抗剂的开发和利用就是其中一个重要方面。植物免疫诱抗剂有多种类型，其中生物源的蛋白质类免疫诱抗剂备受植物保护专家的重视。Harpin蛋白就是这类物质中的重要一类，而且得到了商业化应用。这类物质不但具有安全、高效的特点，而且具有促进植物对病虫害的抵抗力，提高植物产量和改善农产品品质的作用。

（本文节选自刊登于《农药市场信息》杂志2023年第22期的本期专稿，欲知更多精彩内容，欢迎点击下方电子书链接查看。）