有机磷农药毒性降解研究

    自1944年德国拜耳公司首先发现有机磷具有杀虫特性并制造出第一种杀虫剂“1605（对硫磷）”以来，有机磷作为一类高效、广谱的杀虫剂被广泛应用，在很大程度上提高了农作物的产量。这一类农药品种多、药效高、用途广、易分解，在人、畜体内一般不积累，在农药中是极为重要的一类化合物。但有机磷具有较强的毒性，大量使用后造成日益严重的环境与健康问题。含有有机磷的农药通过食物残留等方式进入食物链，并在生物体中进行生物富积，从而造成致畸、致癌、致突变等危害。

    为减轻有机磷农药对生物和环境的危害，减少不必要的损失，有机磷农药降解方法的研究异常紧迫。有机磷农药能够自然降解，但是时间长，在其自然降解之前就给人类带来了不可估量的危害，因此研究其人工降解方法迫在眉睫。目前，对有机磷农药进行人工降解的主要途径如下：一是氧化降解，如用高铁酸钾对有机磷农药残留降解。二是光催化降解，如利用纳米氧化锌对有机磷农药的降解。三是生物降解，研究和应用较多的是微生物降解。

    氧化降解、光催化降解等方法降解有机磷农药虽然处理效果不错，但成本太高，而且容易造成二次污染，因此只能作为一种辅助手段加以利用。生物降解技术是近年来发展很快的一种清除有机污染的环境生物技术。其基本出发点是采用各种方法来加速和强化微生物对环境中有机污染物的降解。该方法的研究始于20世纪40年代末，通过研究已肯定了微生物在农药降解转化中的重要作用，且已分离出许多农药降解菌，并对农药的降解途径进行了研究。这是目前使用最普遍的一种降解方法。目前我国多采用生物降解法，该方法的优势明显，其中生物降解菌种的选择与纯化尤为重要。笔者通过调查研究，就我国采用的生物降解法进行详细的说明，旨在为有关有机磷农药的降解提供理论依据。

    一、 有机磷农药的种类和毒性

    有机磷农药属于有机磷酸酯类化合物，多含有C-P键或C-O-P，C-S-P，C-N-P键的有机化合物，是使用最多的杀虫剂。大部分有机磷农药不溶于水（乐果、敌百虫除外），而易溶于有机溶剂，在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下因水解而失效。目前，世界上有机磷农药的种类已达150多种。它的种类包括甲拌磷、乙拌磷、内吸磷、对硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、杀螟硫磷、敌百虫、乐果、马拉硫磷、甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、甲基内吸磷、氧化乐果、久效磷等，详见图1。

    有机磷农药因其在环境中易降解、残留时间短、对地下水污染的贡献小、对动植物体内酶的活性抑制性小、易受到酶的作用而水解等特性，一直被认为是一种污染较小的农药。但通过对有机磷农药的生态毒理性的研究发现，有机磷农药具有烷基化作用，进入人体后与体内的胆碱酯酶结合，形成较稳定的磷酰化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去活性，丧失对乙酰胆碱的分解能力，造成体内乙酰胆碱的蓄积，引起神经传导生理功能的紊乱，所以说对人体是有毒害作用的。

    二、 微生物降解有机磷机理

    有机磷农药的微生物降解过程有2种：一种是微生物本身含有可降解该种农药的酶系基因，当有机磷农药进入土壤后，微生物马上应激产生出可降解有机磷农药的降解酶，在这种情况下，降解菌的选育较为容易，选育周期也较短；另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系或相关基因，当农药进入环境以后，环境中微生物由于生存的需要，微生物的基因发生重组或突变，产生新的降解酶系。

    科学家认为当微生物对有机化合物的降解作用是由其细胞内的酶引起的，微生物降解的整个过程可以分为3个步骤：首先是化合物在微生物细胞膜表面的吸附，这是一个动态平衡；其次是吸附在细胞膜表面的化合物进入细胞膜内，在生物量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化合物穿透细胞膜的量；最后是化合物进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应。当有机磷农药与微生物混合后，通过对微生物的某种刺激，促使微生物自身所含有的酶迅速增加或因基因适应性改变而形成具有降解效果的酶，在这些酶的作用下，有机磷中的P-S、P-O、P-N等键被打断，使有机磷农药被降解，生成简单无机化合物。其中大肠杆菌产生的磷酸三酯酶能打开甲胺磷的P-S键。这是因为氯代过氧化物酶可以切断有机磷农药中的P-S键。甲胺磷的微生物降解是从甲胺脱氢酶打断P-N键开始的。

    有机磷农药对土壤中的酶活性也存在抑制作用，抑制程度的大小随着外界环境的变化而变化，如pH、氧含量、温度等，而且不同种类的有机磷农药对酶的影响也是不同的，但反过来，有机磷农药对酶的活性也具有一定的刺激作用。如在施用甲胺磷的1~4天内，甲胺磷对土壤中酸性磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在4天以后，对酶的抑制性消失，甚至出现了刺激效应。在7天内氧化乐果和久效磷对土壤中的脱氢酶产生抑制作用，9天后对脱氢酶的抑制作用消失，反而有一定的激活作用。这多是因为微生物在经过对外界环境条件和环境中有机磷浓度一段时间的适应后，微生物内部趋于稳定，这包括酶的产生量已基本与体内有机磷浓度相适应，因而降解速率有一定程度的上升。有时单一微生物无法完成对有机磷的降解，其中原因多样，例如由于有机物开环需要很多的能量，单一微生物自身新陈代谢无法提供足够的能量，需要外界能量的补充；或某一微生物仅具有开环作用，无法彻底完成有机物到简单无机物的转化，需要其它菌种将其代谢后产物进行进一步降解。因而在这种情况下，培养混合菌是一种可行的解决问题的方法。

    三、 降解有机磷的微生物种类

    生态系统中生存着大量的微生物，因其种类多、分布广、繁殖快、易变异、有很强的生化适应能力、对各类人工合成杀虫剂能较快产生适应酶系、完全降解成无机物等特点而一直为研究污染治理的学者所关注。自然环境中存在的部分细菌、真菌、放线菌、藻类等对有机磷农药具有降解作用，目前研究得比较深入的有细菌和真菌两类。细菌包括：假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒杆菌属（Corynebacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、黄单胞菌属（Xan-thamonas）、固氮菌属（Azotomonas）、硫杆菌属（Thio-bacillus）、根瘤菌属（Rhizobium）等。真菌有：曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Tri-choderma）、酵母菌等。此外藻类对有机磷也有降解作用，如小球属绿藻（Chorella）可降解甲拌磷、对硫磷等，详见表1。

    四、 降解有机磷的微生物分离与富集

    获取高效农药降解菌和降解基因的主要途径是从受污染的土壤、水体底泥、污水处理场出口的污泥等受污染的环境介质中进行筛选、驯化、富集和分离。在天然产物的筛选过程中所使用的大多是沿袭了很久的传统技术，如直接洒土法、平板系列稀释法等。这些传统方法可长期使用，非常稳定。但因其不加创新，造成了分离菌种的种类单一，效率不高，重复分离过多，浪费时间和资源，在一定程度上又严重地影响和制约了新的生物活性物质的筛选。

    新近采用的方法有缓冲液稀释法、整合树脂法、分选法和超声波法。目前科学家设计出一个综合的土样处理过程，称为分散和差速离心法（Dispersion and differential centrifugation，DDC）。这一方法综合运用物理和化学手段，如混合振荡、温和超声波处理、化学处理等方法不同程度地破坏菌团的聚集体，使微生物释放出来，通过细度分选，分步收集、接种，将混生的微生物有效地分离开来。中国科学家利用该方法对酸性土壤中嗜酸和耐酸链霉菌进行了选择性分离实验，取得了很好的结果。后人对此方法进行再加工而出现了天然物质作诱饵捕集——干燥分选法。即在土壤中添加诱饵，人工诱导菌群聚集。国外科学家还创造了趋化法，是为了选择分离游动放线菌而设计。因为游动孢子囊能被“C1-”和“Br-”所吸引，通过一个只需具有2个圆孔的无菌塑料物体的简单分离装置，就可将所需菌种分离出来。

    农药降解菌的富集培养方法主要有：瓶培养即液体富集培养法（Batch culture or liquid enrichment culture）、土壤环流法（Soil percolation or soil perfusion）、连续流动培养法（Continuous flow method）。瓶培养作为连续培养是一种有效的方法，它以目标农药作为培养中的生长限制底物，在这种选择压的作用下可筛选到降解目标农药的微生物菌株或诱发出有降解能力的突变菌株。中国科学家在研究氧化塘处理有机磷农药废水时，分离出极毛杆菌两个菌株，对1605和对硝基酚的降解率很高。以下是一些最新的成果：从处理废水的活性污泥中分离出降解乐果能力很强的优势菌种。该菌种能迅速分解废水中的乐果，25小时内能使乐果去除率达58%；从农药厂污染严重的土壤及污泥中分离出一株不动杆菌属的甲胺磷农药降解菌Pm-6。其性能稳定，在4℃下保存30天降解能力变化不大，但需充分供氧。生长最适pH为6.0，最适温度为45℃，该菌还可降解甲基对硫磷和三唑磷等有机磷农药。从农药厂污泥中同时分离到一株以乐果为惟一碳源和能源的曲霉L8和一株可降解甲胺磷的曲霉M-2。曲霉L8 96小时的降解率可达58%；曲霉M-2在质量分数为0.2%的甲胺磷无机盐发酵液中培养5天后，降解率可达81.5%，添加少量有机氯甚至可以促进M-2对甲胺磷的利用。在受农药污染的土壤中筛选得到一株假单胞属微生物，该微生物在pH6.7、温度30℃条件下培养7天，对甲胺磷降解率可达到70%；从污泥中分离筛选到一株共代谢方式可广谱降解有机磷农药的地衣芽孢杆菌，该菌在适宜条件下对甲胺磷、敌敌畏和对硫磷的降解率分别为75.8%、50.3%、25.4%。从农药污染土样中分离出一株具有彻底降解甲基对硫磷的假单胞菌属菌种，该菌对甲基对硫磷的耐受质量浓度在单纯无机盐培养基中可达800mg/L。还有科学家从沿海区域分离了38株有机磷的农药耐受菌，后用分批培养法进行了富集培养，得到了有机磷的降解菌。从海洋中分离富集菌类，利用海洋丰富的生物资源库是一个极具开发研究潜力的新领域。

    五、 有机磷降解酶

    微生物之所以能被广泛地应用于有机磷的降解处理，都是微生物体内产生的具有强大催化作用的生物催化剂——酶作用的结果。另外，如果用微生物所产生的酶来处理农药废水而不是直接使用微生物菌株，可避免对环境造成的潜在危险。研究表明，一些酶比产菌体自身更能忍受异常的环境条件。比如，对硫磷水解酶可耐受高达10%（质量分数）的盐浓度、1%（质量分数）的溶剂浓度和50℃的温度，而产生这种酶的假单胞菌在这种条件下是不能生长的。因此认为用酶处理农药废水更有发展潜力。

    有机磷农药降解酶（Org anophosphorushdro-lase）降解有机磷农药分子时，通过破坏有机磷的磷酯键而使其脱毒。C-P键裂解酶就是决定有机磷彻底矿化程度的关键性酶种，这是因为C-P键是一种稳定的化学健，通过水解、热解或光化学作用都很难将其降解，微生物酶的作用是C-P键断裂的主要作用方式。我国学者通过鸟枪法克隆到一个大小为25000个碱基对左右的甲基对硫磷水解酶基因，并将其转化至大肠杆菌中。同时他还构建了能降解有机氯及有机磷和同时降解3种以上有机磷农药的降解菌各1株，能同时高效降解甲基对硫磷和呋喃丹农药的工程菌1株，在实验室条件下降解性能显著，酶活性提高6倍，获得既有农药降解能力又有生物防治功能的工程菌株。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法。

    六、 结束语

    现阶段，农药的微生物降解研究主要是在实验室纯培养的条件下进行的。由于实验室的环境条件以及农药处理负荷都与自然生态中相去较远，为将微生物降解农药的技术进行推广，未来的研究重点可集中于：提高特定菌株降解有机磷化合物的能力，建立高效降解微生物的基因库；充分利用基因工程，采取基因诱导变异的方法，通过改造其它繁殖力强、活性强的微生物使其具有降解有机磷的能力，提高降解效率；研究有机磷农药微生物降解机理、生物降解代谢途径，中间产物的类型、毒性和积累机理；研究改善微生物降解效果的添加剂及其作用机理；结合当今分子生物学知识和技术，最终将研究成果应用到生态系统或微生态系统中。当然，最重要的还是尽快找到对人体和环境危害性小的、具有专一性的有机磷农药替代产品，从根源上消除有机磷的危害。